1.血糖 血糖低於2.8mmol/L可確定為低血糖症。但低血糖常為發作性的，一兩次血糖正常並不能排除此病，故應多次檢查空腹、發作時的血糖來確定低血糖症。
2.血漿胰島素 血胰島素水平是病因診斷的重要依據。在低血糖發作時應同時抽血檢測胰島素水平。在血糖低而胰島素水平高時有臨床意義。
(1)血胰島素(μU/ml)/血糖(mg/dl)比值：正常人此值<0.3，在血糖<50mg/dl時若此比值>0.4則表示胰島素不適當分泌過多。常見於胰島細胞瘤。應注意一次陰性結果不具有否定意義，對可疑者應多次檢查和計算。
(2)胰島素釋放指數=[血胰島素(μU/ml)×100]/[血糖(mg/dl)-30]，用擴大血胰島素值、縮小血糖值來增加對低血糖診斷敏感性和準確性，對一些血糖很低而胰島素不很高的患者更適用。正常人<50，肥胖者<80，>80表示胰島素不適當分泌，特別是胰島細胞瘤高於100甚至150。
3.血胰島素原/總胰島素 正常<15%。胰島素瘤患者由於胰島素合成旺盛，較多的胰島素原來不及分解成胰島素就被釋放入血故此值升高。
4.糖耐量試驗 可了解血糖和胰島素的動態變化。方法有兩種即5h口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)和3h靜脈葡萄糖耐量試驗(IVGTT)。
口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)：空腹時口服葡萄糖粉1.75g/kg，總量不超過75g，測服糖前及服糖後30min和1、2、3、4、5h的血糖及胰島素水平。整個試驗5h，采血7次。此法常用。
3h靜脈葡萄糖耐量試驗(IVGTT)：空腹靜脈注射葡萄糖0.5g/kg，總量不超過50g，於注射前及注射後30min和1、2、3h測血糖及胰島素水平，整個試驗3h，采血5次。不同病因的低血糖症糖耐量血糖曲線特點。
5.饑餓試驗 對沒有典型低血糖發作者，可行此試驗來誘發低血糖。正常人或功能性低血糖者能耐受此試驗，而90%以上胰島素瘤患者在禁食24h後或終止前2h增加運動，可激發低血糖，少數需要延遲到48～72h才發作。在低血糖出現時血糖<50mg/dl，而胰島素水平不下降，計算胰島素/血糖比值升高(>0.4)。此項實驗簡便易行，但須在醫生的監護下做此試驗，試驗過程中一旦出現低血糖症狀應立即取血分別測血糖和胰島素，同時給病人進食或注射高張糖以終止試驗。
6.刺激試驗包括 包括D860和胰升糖素試驗。
(1)甲苯磺丁脲(D860)試驗：有兩種方法①口服法：試驗前3日每日碳水化合物攝入量不少於300g，試驗前一日晚餐後禁食。試驗日晨口服D860 2.0g。於空腹和服藥後0.5、1、2、3h抽血測血糖及胰島素。病人在0.5～1h血糖下降到空腹的40%以下，至2～3h仍不能恢複，常誘發低血糖。②靜脈法：用D860 1g鈉鹽溶於20ml注射用水，2min內靜脈注入，每5min取血測血糖、胰島素共3次，如胰島素>195μU/ml則提示有胰島素瘤的可能。
(2)胰升糖素刺激試驗：於空腹或進食後6～8h，先采血測血糖，然後用胰高血糖素1mg靜脈注射後每5min測胰島素，如大於135μU/ml，提示胰島素瘤的可能。
上述激發試驗由於刺激胰島素大量分泌而誘發低血糖，對病人比較危險，因此應嚴格掌握適應證，並且在醫生監護下進行。
7.C肽抑製試驗 靜注胰島素(0.1U/kg)後，引起低血糖從而抑製C肽釋放。抑製率≥50%為正常，若不受抑製，則提示有自主分泌的胰島素瘤。
影像學檢查：對於胰島大的腺瘤可采用超聲波和CT來進行腫瘤定位，但大部分腫瘤瘤體較小(多數直徑在5.5～10mm之間)，可采用選擇性胰動脈造影和門靜脈、脾靜脈導管取血測定胰島素和C肽含量來進行術前定位。
