HSV病毒可從氣管支氣管分泌物、支氣管肺泡灌洗液、肺組織中獲得。采用纖維支氣管鏡收集標本應早期進行。經皮細針抽吸肺活檢和開胸肺活檢無多大幫助。皮膚黏膜損害囊泡液體中病毒的最高分離率為80%～98%，當潰瘍結痂和愈合分離率則下降(<25%)。標本的收集和運送在分離病毒過程中相當重要。標本應盡快收集，因為在疾病進展後分離到病毒的可能性減少。收集標本後及時接種，可能有較高的病毒分離率。必須注意運送和儲存標本的條件，在正式檢測前，標本不能放在-20℃的冰箱中冷凍;運送過程中標本可保存4℃ 48h。
HSV感染的實驗室診斷應從兩方麵評價：首先，確定病人是否正在排放病毒，有無存在HSV現行感染以進行積極的抗病毒治療。其次，在可疑患者病毒重新激活出現臨床症狀前，確定病人血清抗體是否陽性，以檢查過去是否感染HSV，以確定在骨髓移植、器官移植、誘導化療前有無必要進行預防性抗病毒治療。
1.細胞培養 組織培養為最敏感和特異的診斷方法，亦可用於病毒的分型。在病毒高滴度的標本，24～48h內可獲得陽性結果，接種後72h內在90%的培養基中可產生特征性的細胞病變效應;而在低滴度的標本，7天後方可看到特征性變化。然而，組織培養並不能始終確立病毒的存在，這是因為標本的收集和運送欠妥以及使用抗病毒藥可能出現假陰性。
2.檢測病毒
(1)Papanicolaou(Pap)或Tzank試驗：是快速、便宜的細胞診斷方法，先進行病變部位的刮片細胞染色，能在20min內顯示細胞改變，即多核巨細胞形成、胞質空泡樣變和包涵體。陽性塗片結果可靠，但不能區分水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)和HSV-1或HSV-2。陰性塗片亦不能排除皰疹病毒感染。在理想情況下，Tzanck塗片約50%陽性，其敏感性和特異性均較低，且依靠檢測者經驗;由於許多技術和實際原因，應用受限。
(2)單克隆抗體間接免疫熒光染色檢查：用於病灶刮片檢查，敏感度為78%～88%，假陽性少見。直接電子顯微鏡檢查很誘人，因為可在2h內完成，但敏感性多變，特異性低。酶聯免疫吸附試驗用於單純皰疹病毒的檢查，敏感度可達95%，特異性高，但標本收集後如不立即檢查其敏感度下降。亦有采用放射免疫分析法檢查單純皰疹病毒。熒光素標記抗體試驗、間接免疫過氧化物酶試驗或使用單克隆抗體的酶免疫分析法等，這些方法價格低廉，快速，不需要細胞培養技術。新近產生的用單克隆抗體進行直接熒光素標記抗體染色的離心技術快速敏感，但更常用於巨細胞病毒的診斷。使用免疫熒光直接檢測HSV抗原，特異性高但敏感性差，且依靠標本質量。
酶免疫測定法(EIA)測HSV抗原，有培養放大技術和直接檢測技術，研究結果顯示：HSV EIA對各種來源的標本高度敏感(93.7%)，高度特異(96.6%);方法簡單，重複性好，快速(4h)，標本受細菌汙染時影響結果，已治愈或正在進行抗病毒治療的病人結果不可靠。氣管支氣管標本和下呼吸道分泌物的病毒培養，陽性結果通常需2～5天，但陰性結果需2周才能確定。
(3)DNA探針技術的應用：DNA探針有助於HSV感染的診斷。DNA探針在細胞形態學可疑時能確定診斷。幾種因素能混淆形態學診斷：①HSV包涵體與巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)和腺病毒(adenovirus)的包涵體相似。②發生HSV和CMV雙重感染時。③除了HSV其他呼吸道病毒也能產生多核細胞。原位雜交使特殊病毒基因組序列定位，它比傳統的確定方法簡單快速。
(4)聚合酶鏈反應技術(PCR)：PCR對HSV病毒感染可提供結論性依據，即使在石蠟包埋組織隻要有一致的病毒病理改變即可。每次檢查必須有陰性對照組織。盡管存在隱性感染的可能性，但對沒有病毒病理改變的對照組織，PCR檢查HSV仍為陰性。如進行合適的對照，該方法快速(1天內完成)，準確特異，敏感性高，能對陳舊或複雜的標本進行處理。PCR和HSV培養結果近似，PCR沒有Tzanck塗片和病毒培養的許多技術和實際限製，PCR在快速診斷可疑HSV病毒感染的免疫抑製病人顯示其優越性。
3.血清學檢查 該方法的最大價值是證明病人已經感染過HSV，血循環中的抗HSV抗體是存在反複感染可能的標誌。抗體滴度增加4倍或更多提示HSV的近期感染。HSV抗體可通過許多方法檢測，包括補體結合試驗，微量中和試驗和酶免疫分析法。這些方法高度敏感和可靠，但血清學檢查不能區分內源性病毒感染和重新感染。血清學檢查結果無診斷意義，無助於快速診斷。另一問題為HSV-1和HSV的交叉反應，故不能確定HSV急性感染的血清分型。僅僅在急性期血清中無HSV抗體時，血清學檢查可用於診斷HSV初次感染，在這種情況下，如果恢複期血清中抗體出現，可稱為血清轉陽現象(seroconversion)。HSV肺炎時抗體滴度不增高常提示預後較差，病毒容易廣泛播散。
4.病毒分型 常用3種方法為單純皰疹病毒分型。首先采用和標準的方法為限製性內切核酸酶切割，並經瓊脂凝膠電泳分離，HSV-1和HSV-2的DNA類型不同，據此很容易鑒別HSV-1和HSV-2。第2種方法為用熒光素標記的特異性單克隆抗體進行病毒的分型，該方法具有對切片和培養基進行快速和直接檢測的優點。第3種方法為使用溴乙烯去氧苷(5-bromovinyldeoxyuridine，BrdU)，該物質在細胞培養基保持適當濃度僅可阻滯HSV-1複製。HSV血清分型對於流行病學很重要，臨床醫生很少需要這種信息，HSV生殖道感染和HSV腦炎例外。
對於非致命性HSV感染，可進行病毒培養的實驗室檢查，因為這種感染常常臨床上即可鑒別，提取標本後數天內可獲得病毒確認。而對於致命性HSV感染，須進行立即抗病毒治療，所以必須進行快速準確的HSV感染的診斷。最好的方法為免疫熒光染色。嚴重HSV感染患者早期進行抗病毒治療有較好的預後。雖然在確診之前可進行抗病毒治療，但快速的陽性檢查結果能促使醫生盡早開始抗病毒治療。新生兒HSV嚴重感染患者可能僅有皮膚損害作為HSV感染的證據，快速診斷檢查尤為重要，如耽誤了診斷和治療，將很快發生其他部位的播散，預後將明顯惡化。在無症狀的HSV感染病人，不能過分強調進行HSV快速診斷試驗。
X線胸片與其他肺部感染較難鑒別。可顯示局限性、多發性或彌漫性間質浸潤，早期可有典型的肺門或彌漫性間質密度增加，支氣管壁增厚，隨著病情進展可見斑片狀肺泡填塞。單純皰疹病毒性氣管支氣管炎胸片可正常。
