1.塗片染色檢查 可從潰瘍邊緣深部或基底部取材，先用生理鹽水洗淨患部，取其滲出物。如為淋巴結穿刺取材，應從健康皮膚處進針，以免形成瘺管。塗片時應從玻片的一端推向另一端，以保持細菌的特征形態。塗片固定後可用Gram、Wright、Giemsa或Pappenheim Saathof染色。約50%可查見長約1～2cm末端鈍圓的二極染色的短小杆菌，Gram染色陰性，單個或沿黏液絲方向呈團狀或平行排列小群聚集。潰瘍處常有與Ducrey嗜血杆菌相似的短小杆菌汙染，但汙染菌無“魚群樣”特征。
2.病原菌培養 可從橫痃或潰瘍損害處取材。常用培養基為淋球菌胎牛血清培養基、Mueller-Hinton巧克力培養基等。2h內接種，置於5%～10%二氧化碳和飽和濕度環境中，於33～34℃至少培養48h。Ducrey嗜血杆菌的菌落直徑為2mm，呈光滑的半球形，黏性極強。
3.鑒定試驗 對已分離出的Ducrey杆菌，應進行生化試驗進行鑒定，有氧化酶試驗和硝酸鹽還原試驗等。
4.免疫學檢查 間接免疫熒光試驗以與Ducrey杆菌外膜成分起反應的單克隆抗體檢測生殖器潰瘍分泌物塗片。酶免疫試驗在培養陽性的本病患者中檢出率為93%，可用於大規模人群的篩選檢查。
5.分子生物學檢查 有核酸雜交技術和核酸擴增技術等，後者又分為PCR和LCR。32P標記的DNA探針已用於鑒定培養中的Ducrey杆菌。用PCR技術檢測生殖器潰瘍中的Ducrey杆菌對本病的診斷有一定價值，但也存在不少問題。
組織病理檢查：
1.皮膚潰瘍 顯示3個層帶，典型者有診斷意義。
(1)淺層：即基底，較狹窄，由中性粒細胞、紅細胞、纖維蛋白和壞死組織組成。用Giemsa或Gram染色可檢出Ducrey嗜血杆菌。
(2)中層：較寬，有多數新生血管形成，血管內皮細胞顯著增生，可導致血管腔閉塞，有血栓形成和繼發性壞死。淺層和中層間可見有水腫。
(3)深層：主要為成纖維細胞增生，淋巴細胞和漿細胞密集浸潤。
2.受累淋巴結 呈重度急性炎症反應，有中性粒細胞浸潤及壞死。
